质粒转化与提取 学习笔记
质粒是进行DNA重组的常用载体，在分子生物学实验中经常会用到。通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上，构建新的重组质粒，目的基因即可以随质粒载体进入到受体细胞中。获得高质量的质粒对下游实验起到非常重要的作用。现在使用试剂盒提取质粒已经比较方便，菌体培养后可以多管浓缩提取，若提取到的质粒较多，还可于-20℃保存用于后续实验。
(资料图片仅供参考)
基础知识：
1. 质粒特性
质粒是在细菌和其他细胞中发现的一种独立于染色体外的小型环状DNA 分子。质粒可依赖宿主细胞中的酶和蛋白质进行独立地复制和转录；通常只携带少量基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因；可以在不同的细菌细胞之间传递。
按照质粒的复制特性（可决定拷贝数），通常把质粒分为两类：（i）严紧型质粒：染色体复制一次，质粒也复制一次，每个细菌内只含1-2个质粒；（ii）松弛型质粒：细菌染色体复制停止后仍能继续复制，每个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。
2. 质粒的分离纯化
质粒分离纯化的过程实际上是将质粒与染色体基因组、蛋白质等其他成分分离的过程。尽管纯化质粒的试剂盒有多种，但其基本原理都相同：
首先，挑取菌落在含抗生素的适宜培养环境下生长。由于质粒携带抗生素抗性基因，只有那些含有该种质粒的细菌才能在这种培养液中生长。
接着，收获细菌并在高pH条件下进行裂解。
然后，中和pH并加盐。由于DNA是一种很强的阴离子，会通过阳离子盐桥和带负电的硅胶柱结合；而其他物质，譬如蛋白质，会随着高盐缓冲液通过硅胶柱而不被吸附。再向硅胶柱中加入低盐缓冲液会破坏盐桥，从而将质粒DNA从硅胶柱中洗脱下来。
最后，离心去除碎片和基因组DNA。
实验步骤：
1. 质粒转化
（i）将细菌置于LB培养基中37℃摇晃过夜后将菌种取出观察活性（浑浊），然后将培养的菌种置于培养液中摇晃活化（使菌种处于对数生长期）；
（ii）高压固体培养基并冷却至合适温度后，按质粒说明书加入抗生素，待平皿凝固后盖上平皿盖，倒置平皿；
（iii）取出摇好活化的菌加入EP管4℃离心，吸出培养基后加入CaCl2制备感受态；
（iv）把制备好的装有感受态细菌的EP管于冰上静置，加入适当质粒后再次置于冰上静置适宜时间，然后于适宜温度热激（打开孔道让质粒进入细菌）后再次插入冰内静置（关闭孔道避免进入细菌的质粒离开细菌）一段时间，加入不含抗生素的LB慢摇（转入质粒的细菌表达出抗性蛋白使细菌耐对应的抗生素）；
（v）将细菌接种至先前制备好的含有抗生素的平板上，倒置平板孵箱过夜（需设置对照——加入抗生素培养基的空白对照和加入未转入质粒菌种的阴性对照）；
（vi）取出平皿观察菌落生长情况，若样品平板观察到菌落且空白对照和阴性对照无菌落生长，实验继续（若空白对照和阴性对照观察到菌落说明污染或抗生素无效；若样品平板无菌落生长说明抗生素加入过多或转化失败）。
2. 摇菌培养
（i）将抗生素按说明书浓度加入 LB 培养基中，挑出样品平板中得到的转化有质粒的单个菌落，连枪头一起打入；
（ii）37℃ 振荡培养过夜。
3. 质粒提取
. 质粒小提（初步验证扩增的质粒是否和原质粒一致）
提取质粒：用质粒小提试剂盒按说明书要求提取质粒。
. 琼脂糖凝胶电泳
（i）制备琼脂糖凝胶：a）选择足够点样口数量的塑料胶槽（点样孔数量=样品数量× 2+marker，需对比提出的样品与原样品是否相同）；b）配置好合适浓度的凝胶后迅速插上合适大小的梳子形成点样孔；c）待胶完全凝固后小心拔出梳子；d）将凝胶置于电泳槽内；
（ii）点样：上样前预电泳3~5 min，将核酸样品与上样缓冲液混合后点样；
（iii）电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm处时，停止电泳；
（iv）凝胶照相：将凝胶板置于紫外灯下进行照相，若大致分子量位置相同则质粒转化成功。
. 质粒大提：
（i）将摇菌培养和质粒小提的剩余菌液混合，用质粒大提试剂盒，按说明书要求提取质粒；
（ii）琼脂糖凝胶电泳确定质粒质量和浓度，将得到的质粒稀释成方便使用的浓度。
参考：
[1] 知乎-实验室基础：一文读懂质粒
[2] 知乎-【实验视频】质粒的提取与纯化
[3] 知乎-手把手教你完成质粒DNA提取实验
[4] 知乎-干货 | 确认过眼神，是要提质粒的人
[5] 知乎-实验室●基础篇 你应该知道的质粒那些事儿
[6] TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解
[7] 知乎-分子生物学质粒纯化技术步骤过程详解
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